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2024-09-27 11:18·南海网

蛊虫之间高出二转就会形成威压方源利用chun秋蝉的气息逼压低转蛊虫的意志令其龟缩一旁从而再用自身真元灌注其意志长驱直入一口吞掉龟缩成一点的蛊虫意志色谱柱相关的100个问题太实用值得收藏2019-06-25 15:33·德斯特cGMP咨询导读色谱柱可分为填充柱和开管柱两大类多为金属或玻璃制作有直管形、盘管形、U形管等形状液相色谱通常均采用填充柱色谱柱的分离效果取决于所选择的固定相以及色谱柱的制备和操作条件今天整理相关网络资料给大家学习交流本文较长欢迎收藏1、网上对柱子是否可以反冲一直有争论那什么样的柱子可以反冲什么不可以反冲后是正者用还是反着用具体到各型号柱子不仅是ODS柱其他如正向柱、氨基柱、离子交换柱等最好都有解释答：一般的正相反相柱应该都能反冲只有两端筛板孔径不对称的柱子不能反冲不过目前这样的柱子已经比较少见了反冲是为了把柱头的污染物冲洗掉反冲后还是正着用比较好以免柱子的两头都被污染我们一直提倡的是：正向使用反向冲洗2、我在做方法开发的时候,用乙腈和水作为流动相,在调整梯度的时候发现,刚开始用60%乙腈, RT为2.5分钟,调到40%乙腈,RT没有变化,30%也没有变化,一直调到20%的时候,RT突然变到了约13分钟,请问这是什么原因?我用的是离子交柱答：离子交换柱的保留时间主要由洗脱液的离子强度和pH决定你现在讲的比较简单需要把你的方法说的详细一点才能做具体的分析譬如分析物是什么情况其含有极性电离基团和非极性基团是什么性质离子交换柱是聚合物基质还是硅胶基质水相是什么缓冲盐3、对于一根常用的c18柱拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护为什么要这样做答：新柱活化实际上是一个平衡的过程除了用流动相平衡外有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡特别是测定分子量比较高的多肽尤其重要因为分子量高的物质分子扩散速度慢平衡所需时间也相应较长具体平衡方式也很简单多进几次样品直到峰面积和保留时间稳定再进行正式进样测定如果要加快平衡时间把前面用来平衡的进样样品浓度加大或者不等洗脱完成连续进样多针用待测物对新柱平衡目的是将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉4、测定多肽一般采用什么柱子流动相是乙腈和水还有微量的TFA特别是像类似三肽的短肽应该怎么选择柱子答：分子量不高的多肽一般选用常规C18柱就能测定也有用离子交换柱、水性C18柱和Hilic亲水作用柱的5、氨基柱在进酸性样品时很伤柱子如使用一段时间后柱效降低峰形改变如何恢复答：氨基柱测酸性样品应该是用氨基柱的HILIC模式酸的存在可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降建议：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨）之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1％6、色谱柱的技术都有哪些比如封尾等这些技术在应用时都体现在哪里答：色谱柱技术包括填料技术和装柱技术填料技术自不待言填料的好坏对色谱柱分离性能和选择性有决定性影响装柱技术也没有想象中的这么简单不同固定相、不同粒径、不同柱管内径和长度装柱工艺都有所不同要装出紧密、稳定、均一的柱床更多是一门艺术需要经验积累国内和国外想比我认为色谱柱的差距在于：国内公司以前都不会自己开发填料一般买国外现成填料装柱买到的填料质量控制权不在自己手里另外因为装柱历史短经验积累少装柱工艺也没有完全达到国外水平另外对色谱柱性能很关键的基础材料-----裸硅胶国产的还不过关在纯度、粒径和孔径的均一性方面和国外产物相比差距很大7、色谱柱技术的差距在哪里答：色谱柱技术包括填料技术和装柱技术填料技术自不待言填料的好坏对色谱柱分离性能和选择性有决定性影响装柱技术也没有想象中的这么简单不同固定相、不同粒径、不同柱管内径和长度装柱工艺都有所不同要装出紧密、稳定、均一的柱床更多是一门艺术需要经验积累国内和国外想比我认为色谱柱的差距在于：国内公司以前都不会自己开发填料一般买国外现成填料装柱买到的填料质量控制权不在自己手里另外因为装柱历史短经验积累少装柱工艺也没有完全达到国外水平另外对色谱柱性能很关键的基础材料-----裸硅胶国产的还不过关在纯度、粒径和孔径的均一性方面和国外产物相比差距很大8、柱子在什么情况下可以清洗一下筛板呢原来也讨论过这个问题我也拆下来清洗过但我看到柱前段的污染更甚于是就用刀片刮了刮然后把清洗好的筛板安装上去问题解决了但使用寿命会不会减少呢答：柱头污染了就取出污染的再装一些填料因为加入你刮了些填料那么微观的塔板数就少了假入你刮得不多仅表面可能就是一些脏物所以问题解决但是今后还会有同样问题再挂那么不小心刮影响柱效建议还是装一个预柱9、如果柱子取下来放置一段时间需要做什么保护吗答：对一般的反相柱也就是洗干净后放到纯甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中然后用堵头塞紧柱两头以免保存溶剂挥发应该不需要做特殊的保护10、流动相中加入适量的四氢呋喃可以改善峰形的机理是什么答：《高效液相色谱方法及应用》于世林编著的上面说：甲醇为质子给予体、乙腈为质子接受体、四氢呋喃是偶极溶剂应该除了极性影响还有另外的影响因素至于分离机理还是比较复杂的不能看成是个万能方法11、对于色谱柱的填装问题我个人认为现在色谱柱的填装一般有3种情况：1.国外生产填料并填装完成成品卖到国内；2.国外生产填料国内填装销售；3.国内生产填料国内填装销售一般情况下第1种情况卖的最贵也质量最好可是我就不明白了：如果是填料的生产很复杂的话那么填装上国内也跟不上去吗为什么换在国内填装就会出现或多或少的一些小问题呢答：国内填装会出现质量小问题和国内目前普遍做事没有国外严谨有关吧如果工艺技术上没有问题又能制订并切实执行一整套严格的生产质量管理措施国内填装和国外填装并无区别12、国产色谱柱在市场上占有比例如何啊答：国内色谱柱市场还没有人进行过科学统计连一年色谱柱销售总量也众说纷云更别说国内生产色谱柱所占份额了我估计是占30%左右吧13、预柱或保护柱用还是不用的问题原来分析中药品种时我一直都是用保护柱但来到新公司后发现大家都没有使用几个实验室连保护柱都没找到一个也就是说大家从来都没有用过后来问一个老员工说是有可能影响药品分析我就想问：安装保护柱后会影响样品分析吗我们做的大多是头孢类的抗生素答：应该这样说加上保护柱肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞肯定有害于分离度和柱效因为保护柱中间有着死体积的存在但是如果保护柱接得好并且尽量控制其匹配性和经常更换分离度和柱效应该影响并不大头孢类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂喽有些原料药可以根据色谱柱的损耗选择添加预柱（中间是个筛板）制剂的话如果有辅料严重干扰或者流动相盐分比较大那还是最好配个保护柱14、用的是四元梯度泵 A50%甲醇 B50%水 经常出现停或进气泡这是什么原因答：水/甲醇比例在55：45时黏度和柱压有个极大值50：50接近了这个极值柱压是比较高的但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径你这个实例中不知用的什么规格的色谱柱系统压力高可能会因溶剂泵中的过滤头供液速度跟不上而导致气泡进入系统停机也应该是因为气泡进入压力下降的原因可考虑更换液体通量更大的过滤头15、填料方法的前三种都是湿法吗能不能对四种填充方法做一个简短的说明资料显示：在正常条件下填料粒度＞20?m时干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20?m时湿法填充较为理想填充方法一般有4种①高压匀浆法多用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法Waters专利；③轴向加压法主要用于装填大直径柱；④干法柱填充的技术性很强大多数实验室使用已填充好的商品柱为什么以20um为分界点16、想请您具体说明一下反冲色谱柱的方法是不连检测器吗答：反冲就是将柱子反向连到系统中因为有污染物反冲出来当然不连检测器出液端直接接到废液瓶就可以17、如果不使用不锈钢接头而改用ＰＥＥＫ头是否可以完全解决接头匹配问题答：色谱柱接头其实大都不是色谱柱厂商自己生产的供货商有多个VICIUpchurchParker等他们的标准相互之间不统一那色谱柱接头的标准就统一不起来不过一般这个问题也不难解决的换个接头就可以了而且现在有了万用接头可以配所有不同类型的柱头不泄露连接死体积又很小18、有的厂商为避免堵塞使用了较大孔径（2-5um）的前筛板这种情况反冲会将填料冲出那么你们在使用说明书中会说明前后筛板的孔径吗答：如果前后筛板孔径不对称厂商肯定也会在说明书里特别提到的19、我在做多肽药物时遇到下列问题：1）. 基线不稳定波动大流动相 A ：1％TFA水溶液 B:1％TFA乙腈溶液检测波长210nm 流速1.0ml/ml 什么原因怎么解决TFA有什么作用流动相中不加TFA见不到主峰基线良好2）做完肽类样品时怎么冲洗C18比较好；3）药典上介绍测定分子量大于2000的样品选择柱子填料的孔径为30nm30nm与10nm对结果有什么区别答：应该是起离子对的作用吧在做多肽类样品的时候300A孔径的填料相对100A孔径肯定要选择性好点也就是分离度相对比较好点流动相加入TFA在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发可以方便地从制备样品中除去另一方面三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于 200nm 对多肽在低波长处的检测干扰很小20、waters AtlantisC18柱可以用较高比例的流动相那麽用完后应该怎麽清洗在什麽体系中保存比教合适答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗维护：流动相中不含缓冲盐分析完成后用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min流动相中含有缓冲盐分析完成后先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向冲洗45min然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易长菌使用时间不可超过3天）；水性柱保存体系也不特别：短期保存在所用的流动相中（不含缓冲盐）中长期保存在纯甲醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中21、正相硅胶柱一般保存在什么溶剂里面比较合适答：短期和长期都建议保存在正相测定所用的流动相中一般是正己烷和极少量的异丙醇22、磷酸盐缓冲盐渗透力强为什么是因为与醋酸盐枸椽酸盐相比基团小吗使用磷酸盐缓冲液与其它缓冲液相比会使色谱柱寿命缩短多少答：经常用磷酸盐在其它条件差不多一样的情况下柱子寿命肯定比不用磷酸缓冲盐相对短一些但用磷酸盐也有不可取代的优点吧否则不可能现在大部分人还在用23、反相离子对色谱法中离子对是如何起作用的是离子对试剂的非极性端溶解在填料的非极性端里解离端伸向流动相对含胺化合起离子交换作用还是样品与离子对生成紧密的结合物离子对试剂掩藏化合物中的极性基团还是这种结合物是在解离与结合的动态平衡之中答：首先离子对试剂的解离端和目标离子形成离子缔合物降低其极性这样就能较好的在柱子上保留再者根据疏水效应理论离子对试剂的疏水端是很容易和C18链相互作用的这样更容易在柱子上保留所以我认为离子对试剂作用是混合保留机制即纯粹的反相保留和离子对保留机制共同作用24、四烷基季铵盐（如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等）在水中电离后也形成了类似N＋H(CH2CH3)3的结构N＋(CH2CH2CH2CH3)4这种结构也能有效的与Si－O－产生较强的静电作用此类离子对用的比较少但它的作用仅是掩藏Si－O－吗它对物质的保留性能有何影响实验中发现检测胺化物时流动相中加入磷酸缓冲盐有增加物质保留的趋势而加入三乙胺则会降低物质的保留能力答：前面提到的四丁基氢氧化铵等离子对试剂确实不如辛磺酸钠等极性基是阴离子的离子对试剂用得普遍原因是酸类极性物质很容易通过降低pH值的方法提高在反相色谱中的保留能力降低pH可抑制酸的电离使酸处于中性状态而与疏水碳链的作用力增强而碱类分析物则受硅胶基质pH上限的严重影响（以前上限是8后来抬到10直到最近杂化硅胶才将pH上限提到12左右）铵盐类离子对试剂确实有辛磺酸钠等所不具有的屏蔽硅醇基作用但其主要作用还是疏水端和疏水固定相结合外露的阳离子亲水端和酸阴离子作用从而提高其保留能力当然同样还有第二种解释机理离子对试剂先和分析物结合掩藏极性基从而提高极性分析物在反相色谱中的保留能力而且丁基比辛基疏水性差这种情况下认为后面的结合机理占上风的可能性更大检测胺类化合物加入三乙胺预先和硅醇基结合胺和硅醇基作用被三乙胺取代保留下降是肯定的25、同一根色谱柱在分析完三聚氰胺后再分析苯甲酸、山梨酸、糖精钠时为什么保留时间会提前答：色谱柱被强保留物质污染后保留时间提前和滞后的情况都有具体要看污染物的性质还要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情况情况比较复杂有时候比较难预测是提前还是滞后不过你平时维护的时候注意在测定后将污染物用有机溶剂反冲清洗就可以减轻或避免这种情况的出现建议每个分析方法用专门的色谱柱长远看这样更节省色谱柱的费用26、HPLC柱前衍生和柱后衍生的相关问题1）为什么要衍生2）衍生化的分类3）进行衍生适用的化合物有哪些4）进行衍生化的要求有哪些5）柱前衍生和柱后衍生的优缺点答：色谱技术中的化学衍生法系指在色谱过程中用特殊的化学试剂（一般称为衍生化试剂或标记试剂）使样品成分转变相应的衍生物之后进行分离检测或进行检测的方法目的为：1．将紫外—可见强吸收功能基团引入被检测对象或将其转变为荧光衍生物以提高检测灵敏度；2提高对分析样品的分离和选择性从是否与HPLC系统联机的角度化学衍生法分为在线on line）与离线∣Off line）两种从发生衍生化的场合分为柱前衍生法pre-columnderivatization）与柱后衍生法（post-columnderivatization）两种目前在HPLC中以离线的柱前衍生法（简称柱前衍生法）与在线的柱后衍生法（简称柱后衍生法）使用居多27、多个样品不好不离的时候请问该怎么通过选择合适的柱子来提高分离度答：提高分离度可从三个主要影响因素来考虑柱效、选择性和保留因子可通过减小填料粒径和增加柱长提高柱效；选择性和固定相选择以及pH条件有关通过选择合适的色谱柱和合适的pH可以提高选择性；有时候适当延长出峰时间增加保留因子也可提高分离度28、苯基柱氰基柱该什么时候考虑用答：苯基柱用于含苯环的芳香族化合物的测定时具有较高的选择性CN柱可作为一个保留能力最弱的反相柱使用也可作为一个活性降低的正相柱使用（保留时间比硅胶柱和氨基柱低很多）29、同样类型柱子还有长度粒径等差异这些该怎么去选择答：长度和粒径都是用来改变柱效的选择原则是够用就好30、我前几天刚刚装上一个新的C18柱在进样之前我用100%的甲醇冲了半个多小时刚才看到上面写的要活化什么的不知道我只冲洗半小时就开始用对柱子有没有影响对出峰什么的有没有影响呢答：不是所有的测定都需要对新柱子用所测样品老化但先按方法程序进样几针观察到峰面积保留时间不再有明显变化再开始正式测定这是一个好习惯按你现在的做法如果第一针和第二针的峰面积、保留时间没有变化就继续做没影响吧31、现在色谱柱和仪器的接口还没有标准化吗除了检测池的出入管较小外色谱柱的接口与ＰＥＥＫ头不匹配的有哪个型号的色谱柱以后使用的时候需要注意一点同时发现使用过金属接头的色谱柱再换成ＰＥＥＫ头常易漏液这是因为金属头易使色谱柱接口变形吗答：色谱柱接头其实大都不是色谱柱厂商自己生产的供货商有多个VICIUpchurchParker等他们的标准相互之间不统一那色谱柱接头的标准就统一不起来不过一般这个问题也不难解决的换个接头就可以了而且现在有了万用接头可以配所有不同类型的柱头不泄露连接死体积又很小32、普通的C18柱能作为正相色谱柱使用吗正相色谱体系中最常用也最普通的是那种色谱柱正相柱在使用过程中与反向柱相比有什么需要注意的地方答：普通C18柱作为正相柱使用我还没听说过正相色谱分离模式是指固定相的极性比流动相的极性大反过来流动相极性大就是反相C18固定相属于疏水性相对比较强的疏水性强就是极性很弱应该找不出极性比它更弱的流动相了正相体系常见的柱子有：硅胶柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱最普通的应该就是硅胶柱正相柱和反相柱比最需要注意的是水分正相柱对水分非常敏感流动相中水分含量的些微变化对保留时间影响很大因此正相柱测定前平衡时间需要几个小时甚至更长33、色谱柱的柱头类型与不锈钢毛细管接头有6种连接方式（在讲义里面提到）那么我们用户一般是液相色谱仪是固定某一个厂家而是根据样品检测需要更换不同类型的色谱柱那么怎么判断我所购买的色谱柱是否与不锈钢毛细管是否匹配呢我之前只是知道安捷伦和waters都有规定他们自己家的柱子与自己家的仪器配套是最合适的而其他厂家的色谱柱都很少提及在不知道的情况下我们该怎么选择月旭的色谱柱柱头类型属于哪一种类型呢答：不锈钢毛细管接头有个缺点用过一次后卡匝位置和距离毛细管末端的长度就固定死了如果下次用的色谱柱的柱头接口深度和原来的不同就容易产生死体积和泄漏产生的死体积一般不大如果只引起柱效的稍微下降而没引起拖尾这个问题就容易被忽略引起大家关注的是泄漏如果用了新柱子发现和毛细管的接口处有泄漏就可以判断是接头的匹配问题最好的判断方法还是：询问一下厂商色谱柱柱头的类型和柱头接口的深度然后和毛细管接头的规格比较如果用PEEK接头发生问题的情况就大大减少因为PEEK接头卡匝位置是不固定的接头与色谱柱的匹配并没有在实际色谱应用中造成很大的问题有很多人都没有关注到这个问题一方面原因是使用PEEK接头的情况很普遍另外如果发现不匹配换个毛细管接头还是非常方便的34、相对于气相色谱液相的优势在哪里做防腐剂分析时流动相加入乙酸铵才可以出峰原理是什么答：液相和气相相比的优势有很多,我认为主要在于应用范围更广气相只限于容易气化的低分子量物质的分析测定对象大部分是基础化工原材料；而任何能溶解于某溶剂的物质都能用液相分析适用对象是分子量从几十到几万的广大范围在制药、化工、环保、食品和刑侦等诸多重要领域液相都已成为主导的分析分离工具也有两者都能应用的交叉情况但液相的制样更简单液相色谱的出现克服了气相色谱不能直接用于难挥发、热不稳定及高分子化合物的弱点35、您提到磷酸盐缓冲盐渗透力强有加快硅胶溶解的副作用它的存在会降低pH使用范围既然这样经常使用柱子寿命是否也下降的快呀答：经常用磷酸盐在其它条件差不多一样的情况下柱子寿命肯定比不用磷酸缓冲盐相对短一些但用磷酸盐也有不可取代的优点吧否则不可能现在大部分人还在用36、CN柱的保存需要在低温条件但是又不能太低使固定相冻结怎么控制这个温度怎么判断固定相是否被冻结固定相冻结后会是什么样的现象答：所谓低温储存就是放到阴凉处或者放到冰箱的冷藏室储存液只要不是纯水冰点都比较低纯甲醇的冰点是零下90度以下了37、我们测试样品时经常会关心柱压是否太高但是在购买色谱柱时并没有说每一根色谱柱的最大使用压力是多少针对这样的情况用户怎么判断柱压是否超过该柱的极限答：装柱时的压力比使用时高很多所以柱压对色谱柱本身在使用时没有极限问题存在倒是一般仪器有个40Mpa的上限如果色谱分离度还能满足分析方法要求柱压只要仪器能承受就OK吧38、使用缓冲液不当使硅胶溶解并重新形成粉末后会出现什么样的异常情况怎么处理答：出现异常就是柱压升高小粉末在流动相不断冲洗带动下最后会聚集在柱子出口端沉积在后筛板处理方法只有拆下后筛板进行清洗或更换但这样做会影响到柱床处理后柱效会下降39、今天才知道滤膜的材质分了这么几种：再生纤维素、聚四氟乙烯、硝酸纤维和醋酸纤维等之前只知道有有机系和水系之分各种不同材质的滤膜适合于什么样的样品答：再生纤维素膜：具有蛋白质吸收低适用于水溶性样品和有机溶剂；聚四氟乙烯：适用于所有有机溶剂酸和盐；尼龙66：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液可用于强酸70%的乙醇二氯甲烷不适用与二甲基甲酰胺；醋酸纤维：不适用有机溶剂特别适用水基溶液40、我原来遇到个这样的问题一直不知道原因刚拿柱子做色谱条件是成熟的绝对没问题但是该条件下保留的物质变的不被保留比如本来保留时间15分钟却怎么调比例都是2-3分钟就出峰了维护后下次再使用又正常了什么样原因啊答：最大可能是发生相塌陷了C18柱和高密键合封尾的C8柱在高含水流动相下会发生相塌陷后果就是保留能力大幅下降用有机相比例较高的流动相冲洗后又可恢复正常性能41、UPLC色谱柱可以反冲吗hplc的色谱柱可以简单反冲但是uplc的色谱柱.也是一样的吗如果压力偏高该怎么办答：如果两端筛板孔径对称UPLC柱应该也是可以反冲的发现压力偏高当然也可以用反冲清洗的方法维护uplc柱和普通色谱柱比只是压力高一点不应该有什么特殊吧42、常规LC的柱子粒度小柱效高现在有3.5um的常规柱不知道用3.5um*250的压力与4.6um的压力相差多少答：一般柱子4.6mmx250mm指的是其内径和长度粒径才用um的单位但一般标的是5um也有3.5um的其它条件一样光粒径是3.5um和5um的柱压差别理论上3.5um柱子的柱压是5um柱子的(5/3.5)平方倍数即2.04倍简单说就是2倍43、因为不知道流动相已走完液相色谱柱空走了大概一晚上请问这种情况下柱子还能用吗如果可以应该如何再生答：能用的可能柱子里会有气泡进去但之后多用流动相冲冲看到基线稳定就没问题了用色谱柱的保存液低流速长时间冲洗然后再检测一下柱效看柱子是否恢复液相最好设置一下最低压限这样就不怕流动相走光而会损伤色谱柱44、在梯度洗脱的时候如果整个时间程序越长保留时间的重现性越差尤其是后出的峰重现性差更明显我猜估计是流量本身的误差引起的但是怎么尽量避免这种情况的出现使保留时间重现性更好答：这个要控制好环境温度和柱温易挥发的流动相要适当密封同时保留时间的漂移与仪器的精度也有关系45、我对聚苯乙烯-二乙烯苯柱很有兴趣主要是它耐高温、耐酸碱、但有关这方面的文献很少但对于他的分离效能我一直心里没底我的问题有三：1、分离效果与ODS比较是相当呢还是更胜一筹或是更差2、我原以为它是整体住但看过资料后发现也是颗粒的比如5u请问该类型的柱是否符合速率理论、是不是粒径越小分离效果会几何级的增加3、问什么没有1.7u的这种柱出现呢答：聚合物基质色谱柱的优点你已经提到了它的缺点有：对小分子分离的柱效相对硅胶基质色谱柱要低表面衍生化修饰也没有在硅胶表面丰富机械强度低耐压性不好还有碰到某些有机溶剂会溶胀等聚合物基质柱当然也符合速率理论它柱效低主要是因为分析物在聚合物固定相中的传质速度比在硅胶表面固定相中慢很多不过粒径越小柱效几何级增加的规律还是有的1.7um的硅胶基质填料也是最近几年才商品化1.7um的聚合物基质没出来也正常或许永远都不出来了因为聚合物耐压差粒径做这么小它根本承受不了这个高压吧但愿以后会有能抗高压的聚合物填料研究出来46、我之前有了解到贵公司也有手性色谱柱之前买过大赛璐的手性柱其手性柱价格相比普通反相色谱柱要高出很多倍不知道是本身柱子装填技术的难度大还是其他什么原因它的主要技术关键在什么方面答：手性柱技术关键在于手性填料的开发大赛璐公司在手性填料的生产技术方面申请了专利保护别的厂商不能生产导致手性柱价格居高不下前几年传说该公司的专利保护期限快到了国际国内有些公司就想着仿制生产后来又听说专利还没到期情况不明47、样品与离子对生成紧密的结合物离子对试剂掩藏化合物中的极性基团这句话是什么意思离子对怎么样掩蔽化合物中极性基团不就是通过静电引力的作用形成离子缔合物来降低其极性的吗答：离子对色谱是解决强极性物质在反相色谱中保留能力不足的一个有效的途径有些碱性极性物质即使用100%水相做流动相且无论在色谱柱能承受的pH范围内怎么去调节pH保留能力都不够如果需要分离的组分中全是可以离子态存在的那还可以选择离子交换色谱进行分离不然的话就只有选择离子对色谱方法了尽管它有流传的那么多副作用存在离子对试剂含亲水基和疏水基很像表面活性剂所以一开始离子对色谱也称为皂色谱离子对作用的机理有两种解释你上面都已经提到了到底是哪种解释对尚无定论实际上也没必要去定论反正两种解释都通就可以了我个人认为两种机理都可能存在要看离子对试剂、固定相和分析物这三者本身情况而定如果离子对试剂的疏水端和固定相之间的结合力相对更强示意图的作用机理会占上风反之离子对试剂亲水端和分析物导致掩藏极性端的作用力更强你后面提到的机理更可能总之要看你用的什么离子对试剂是何种的分析物等具体情况不同而不同吧48、我们在用的氨基柱时有时候峰型突然变宽有拖尾用一段时间就又好了不明白是什么原因造成的如果要再生氨基柱的时候应该怎么做呢是像您先前回答的问题中提到的用一定比例的氨水冲洗吗氨基柱可以直接用纯水冲洗吗记得当时买的氨基柱那个使用说明书上说不能用纯水冲是这样的吗如果可以冲的话一般冲多久答：氨基柱的硅胶孔内的氨基浓度非常高（大约有1mol/L）在有水存在的时候在孔内形成一个pH10左右甚至超过10的很强的碱性小环境并会导致硅胶基体慢慢溶解不过硅胶基体的溶解会生成酸性的硅醇基又会降低孔内的pH值延缓硅胶基体的溶解进程一段时间后两个相反的过程会达成一个动态平衡从而稳定下来对你问题提到的这个现象我想到的是这个原因氨基柱要看氨基柱的应用模式是正相还是HILIC这两种模式的情况是大不相同的正相使用一般很怕有水但HILIC模式应用一般流动相是乙腈/水是不怕水的不过键合氨丙基基团非常容易水解所以一般氨基柱不适宜保存有水的溶剂中作为正相应用时流动相中要求一点都不能含水但清洗柱子上的污染物质是可以含水的因为水有强极性在正相色谱上洗脱能力极强当然不必用100%纯水氨基柱具体冲洗方法正相条件按照正相硅胶柱的清洗方法HILIC模式按C18柱的清洗方法49、采用国标用C18柱测定辣椒精辣度将辣椒精中添加吐温系列乳化剂做成水溶辣椒精请问乳化剂对C18柱是否有影响答：乳化剂和离子对试剂类似有极性端和非极性端肯定会对C18柱有影响不过如果辣椒精是极性物质乳化剂的存在到可以提高其在C18柱上的保留能力50、公司按照国标测定辣椒红色素中苏丹红含量标品分离很好峰也不错但是辣椒红色素由于跟苏丹红性质很相似且颜色较深分离效果很差收得率很低测定结果偏差很大该如何处理样品色素是否会降低柱效答：色素不会降低柱效但辣椒红色素主峰浓度过大会影响与临近杂质峰的分离可考虑稀释样品或试试用柱效更高的柱子51、通常我们在分析天然药物成分的时候结构复杂无法考察组分的PKa值哪我们如何去选择最合适的流动相或者是拖尾该怎么改善呢答：如果天然产物中没有易电离的极性基团就不需要用缓冲盐调节pH如果天然产物中既有酸性基团也有碱性基团譬如有pKa=6.2的羧基和pKa=9.0的氨基的两性物质建议将pH用磷酸盐缓冲盐控制在2.4（如果是诸如月旭的Ultimate LP-C18这样的耐酸色谱柱还可以调得更低）如果pH控制在6.2-9.0之间两个基团都处于离子态保留能力最差是最不可取的如果不清楚复杂物质中含有什么基团也请将pH调到2.4或更低因为pH调低起码抑制了酸性基团的电离而处于中性分子状态而增加酸性基团这个部分在反相色谱中的保留能力；另外低pH还抑制了硅醇基的活性有利于获取对称的峰形情况不明时候为什么不建议调高pH呢一方面一般色谱柱都不能承受pH9以上的条件；即使是像月旭的Xtimate系列一样能耐12.5的柱子调高pH和调低pH相比还有一个硅醇基活性大的劣势52、记得以前拿到C18柱会用甲醇从小流量到大流量慢慢活化这样做的目的是什么呢是先用溶剂活化吗然后再用样品还有测定短肽总是冲出来该怎么解决呢就是和溶剂峰出在一起或者出在溶剂峰之前?答：C18柱会用甲醇从小流量到大流量慢慢活化因为色谱柱到达用户手中时时间长短不一在存储和运输的过程中可能存储液有些挥发低流速的甲醇可以很好的浸润固定相使键合相很好的伸展用溶剂平衡好系统后可以采取多次进样或者加大进样量的方式以更快的获得重现的色谱图这样用样品将色谱柱中的活化点饱和就不会出现异常色谱现象的情况53、C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性环境中会对柱子有什么损坏吗ph在2左右答：pH2左右容易使键合在硅胶基质上的固定相水解流失包括C18和封尾试剂的水解封尾试剂相对更容易水解不知道你保存的酸性环境是不是含有缓冲盐如果不含缓冲盐只是短期几天保存在酸性流动相中也不必过份担心最多相当于这几天一直在使用这根色谱柱因此减少几天的使用寿命吧；有缓冲盐就麻烦一点保存期间水分挥发可能会导致缓冲盐结晶在柱内析出对柱子损伤很大54、色谱柱的安装有什么技巧吗只要保证不漏就行了吗还有所谓的死体积怎么测定呢答：色谱柱安装技巧不多只要接头和柱头匹配确实拧紧不漏就可以了但也要注意不要拧得太紧以至于损伤螺纹所谓死体积就是完全不保留的物质出峰时从进样到流过色谱柱的总体积一般用极性非常强的尿嘧啶的出峰来测定死体积包括柱体积（色谱柱内溶剂能占据的空腔体积）和柱外体积两部分你从厂商这里买到色谱柱柱体积已经是固定了你能尽量避免减少的是柱外体积进样器内死体积、毛细管长度、毛细管和色谱柱连接紧凑与否保护柱或在线滤器产生的死体积大小都对这个有影响样品在柱内除扩散外还有和填料作用引起的组分分离；但样品在柱外那就只有扩散这个使柱效下降的因素了所以要取得好的分离效率柱外体积应该是越小越好峰有时候前延有时候拖尾一般不是色谱柱的问题应该是样品和色谱柱填料的作用问题可以说如果色谱柱类型选择没问题关键就是色谱条件的选择包括进样量、样品溶剂、流动相组成（包括添加剂）、流动相pH以及柱温都对峰形有影响另外测定分子量较大的多肽用样品老化平衡色谱柱很重要分子量越大的物质需要平衡时间越长如果柱子没平衡好峰形也可能会不正常所以最好把你具体的测定条件也列一下也便于有针对性的分析原因55、测定多肽样品时十几肽或者二十几肽时有时峰前延的比较厉害有时峰拖尾比较厉害这是什么原因呢是样品的问题还是柱子的问题答：峰有时候前延有时候拖尾一般不是色谱柱的问题应该是样品和色谱柱填料的作用问题可以说如果色谱柱类型选择没问题关键就是色谱条件的选择包括进样量、样品溶剂、流动相组成（包括添加剂）、流动相pH以及柱温都对峰形有影响另外测定分子量较大的多肽用样品老化平衡色谱柱很重要分子量越大的物质需要平衡时间越长如果柱子没平衡好峰形也可能会不正常所以最好把你具体的测定条件也列一下也便于有针对性的分析原因56、柱子的平衡时间跟填料关系大吗哪种最快哪种最慢因为我在做离子交换柱的时候平衡是相当的慢答：根据色谱速率理论粒径越小柱效越高而且当粒径小到亚2微米左右时线速度的提高其分离度就不再降低从而改变了许久以来人们不得不在 速度和分离度之间取舍的局面57、对于配置流动相有机相我们可以甲醇乙腈同时用这个是基于什么考虑的是不是根据甲醇乙腈选择性不同、样品在这个两者的溶解度的差异以及调节洗流动相脱能力来考虑的答：甲醇和乙腈同时用可以获得单纯的甲醇或者乙腈不一样的选择性而且洗脱能力也会改变根据多元流动相的强度因素Sab.....=Saψa+Sbψb=...Sa和Sb纯溶剂a和b的溶剂强度因素；ψa、ψb分别为a和b的体积分数所以在药典中有很多体系都使用甲醇乙腈体系；58、三乙胺磷酸盐缓冲液作流动相柱压一天比一天高该怎么样解决答：把柱子再生下再生的方法搜一下有很多反冲对绝大部分色谱柱都是可行的效果不错59、新出厂液相色谱柱保护溶剂一般是什么怎样进行平衡清洗比较好一般要平衡多长时间比较好答：柱子类型不同保存溶剂也会不一样吧具体要看说明书的说明对于反相柱一般用甲醇（乙腈）保存也有用80%左右甲醇浓度的甲醇/水保存的一般用流动相平衡冲洗10-20个柱体积即可（注意：柱体积不等于空柱管体积4.6x250mm的色谱柱空柱管体积是4.15ml而柱体积只有约2.5ml）60、据说液相色谱柱柱压达到一定高度就不能使用了请问一般达到多高用甲醇和乙腈是不是不一样答：柱压不是色谱柱不能使用的唯一因素分离度才是最重要的柱压只要没高到仪器不能承受的地步例如超过300bar就可以一直使用甲醇的粘度比乙腈高同样状况的柱子如果用甲醇做流动相柱压可能超了换用乙腈会使柱压下降不少仪器还能承受不过尽管柱压还没上升到接近400Bar的限定如果发现柱压上升速度较快也需要及早对柱子进行清洗维护从根本上排除导致柱压上升的源头61、柱塞板可不可拆下用超声波清洗会有什么不良后果答：不建议将柱筛板拆下清洗因为拆下承压的柱筛板会导致柱床发生变化影响色谱性能应该对污染的色谱柱先进行清洗维护维护没有效果再把拆洗柱筛板作为最后的手段62、一般正常使用一个C18柱能用多长时间答：柱寿命一般不按时间计算按持续进样针数比较科学一般正常使用维护不超过pH和温度等范围C18柱能达到500-2000针进样的寿命视样品干净程度的不同而不同63、超高压快速高分离度色谱柱是不是未来液相色谱柱普及应用的一个发展趋势答：这是个大话题今后使用会越来越多是肯定的但是否会替代普通压力的液相还有争议超高压也有使用上的不便譬如容易堵对设备硬件要求高等有机会我再谈谈超高压液相色谱方面详细的一些情况月旭公司作为专业的色谱柱生产商今年也会推出自有品牌的超高压液相色谱柱以满足不断增多的客户需要64、如果液相色谱谱图基线漂移很大是不是柱子的问题波长越小的越大270nm的还不怎么能看出来230nm的就非常厉害了有可能是什么原因造成的答：有可能是你的流动相的问题230可能已经快到你流动相的截止波长了当然紫外吸收强基线漂移厉害65、我们有一台waters1525色谱仪最近基线总是呈现波浪形很有规律波长越小越明显梯度洗脱时向上飘逸而且后一段时间呈现波浪形很影响分析我想问一下是不是柱子的原因用的是C18上海安普的答：应该是流动相组成变引起吸收本底变化造成的特别是在波长小的时候乙腈的截止波长低于200nm但甲醇和水相对比较高在低波长时甲醇和水有一定的本底吸收梯度进行时随着不同本底的组分含量的变化基线也会有相应的波动66、我是做农药残留分析的用的是UV2487检测器想问一下C18色谱柱用什么缓冲液比较好我以前做三聚氰胺是用柠檬酸辛烷磺酸钠也用农药检测行不行还有用HLB柱能不能去除蔬菜和水果中的杂质答：C18色谱柱用用磷酸盐醋酸盐就比较好啊离子对试剂不是个好东东你要慎用我们做三聚氰胺用三氯乙酸67、液相色谱柱一般使用寿命多长不同类型的色谱柱是否寿命也不一样液相色谱柱与气相的柱子有何区别呢答：液相色谱柱一般使用寿命多长我有一根柱子用了大约1年半左右发现同样浓度的样品它的峰展宽了说明柱效下降但是不影响结果因为峰面积还是接近所以做色谱之前先做下柱子性能测试第一次的图谱要保留测试C18 RP柱一般用到萘作为柱子的柱效判断一般是18000片对称性（usp）0.95-1.05间液相色谱柱与气相的柱子有何区别呢HPLC 是走液体的分正相反相反相为例Si 接着C18（键和相）,电镜下看起来像绒毛一样的所以一般用甲醇乙腈保护RP柱这样它的绒毛呈舒展状GC 走气体的固定相涂布固定液68、1.水相指的是什么纯水2.我们实验室的CN基柱保存在40%的乙腈里面这个有不良后果吗答：水相就是纯水CN基不适合保存在中等极性的溶剂中除了可以低温保存在极性较大的纯水中外还有可以保存在非极性溶剂如正己烷中40%乙腈水属于中等极性溶剂短期过夜保存可能问题不大长期保存不太好后果就是可能会发生柱床坍塌69、CN基柱应该怎样维护才好呢比如做完实验用什么流动相冲柱子、短期用什么溶剂保存、长期用什么溶剂保存等等答：CN可作正相柱也可作反相柱用除了保存溶剂有特殊要求外其它维护办法和一般正相和反相柱没有多大区别70、月旭公司的液相色谱柱接头是大众的还是有自己的规格我们是waters的分析仪有月旭的产物可不可以答：月旭公司的色谱柱柱头的规格是大众的因为我们也不自己生产柱管和柱头月旭的柱管柱头供货商也是和一些Waters、Agient和Phenomenex一样的也许是同一家月旭柱头规格标配是Valco型但也可以按照客户要求提供Parker型和Waters型你用Waters的仪器而开始也用的是Waters柱子如果是用不锈钢接头匝扣的位置就固定了如果用月旭的柱子可以把固定匝扣位置的那段剪掉换一个新的匝扣就可以重新固定匝扣位置当然如果你已换成PEEK接头问题就不会很大71、色谱柱的接头出口处用的是peek接头请问都用peek接头不行么为什么答：都用PEEK接头我认为都可以的当然PEEK接头的质量要过关有人认为PEEK接头不耐压估计是针对品质不好的产物说的72、我们的液相为了节约成本我们自己填保护柱用废的同型号柱子填但填完以后做标样定量分析有所改变请问其原因答：不建议自己填保护柱柱芯填得不好的柱芯会影响分离效果也会影响定量分析结果你不知道废柱子里的填料是不是受了污染另外你填的柱芯肯定没有厂商填得好如果影响到峰形峰面积积分结果有所改变是可能的73、请问怎么测柱效柱子填料是SinoChrom ODS-BP 5um 规格4.6mm*200mm答：测定柱效不同公司不一样有用甲苯也有用萘的一般柱子里面有检测报告你按照报告里的方法做一遍就可以74、我用苯试了一下峰性大大好但是不知道理论塔板数不知道怎么评价感觉不大好对称性不好有点前延柱子才用了四个月是什么原因呢是不是塌陷了呢有什么补救的办法吗答：用了四个月峰形拖尾是很正常的需要维护清洗一下色谱柱以清除引起拖尾的柱头污染如果柱头塌陷则不好办从其它废柱子里取点填料填补塌陷可以一试但效果不一定好色谱柱是耗材测定进样针数如果达到500以上了也算是物有所值物尽其用了报废了也不可惜75、流动相里之前有酸的做完后单纯用乙腈冲洗能把酸冲洗干净吗之前他们是这样冲的现在怀疑柱子塌陷了会不会是长时间在酸性环境中造成的呢答：流动相里有酸应该先用纯水或80：20的水/乙腈溶剂冲洗吧如果一直在酸性环境固定相容易流失造成保留时间前移和其它色谱性能下降76、我前一段时间做三聚氰胺用C18色谱响应值很小几乎无法检测可是检测标准就是用的C18后来我用RP18结果响应值很好不知道什么原因请问这两个柱子不都是反相色谱柱么他俩之间有什么不同答：RP18就是C18吧不过C18柱之间也有区别测定三聚氰胺一般要用极性比较大的水性C18柱77、磺化交联的苯乙烯-二乙烯基共聚物为填充剂的色谱柱在储存过程未注意放在冰箱中导致发霉后柱效急剧下降能何种方法将此色谱柱修复好答：聚合物柱子因为不怕酸碱就直接用强酸强碱清洗如果是H型用1M硫酸冲洗；如果是Ca型可以先用1M硫酸冲洗再用EDTA钙盐转换回Ca型柱；如果是中性的聚合物反相柱直接用1M的NaOH冲洗78、我有一个标准的稳定性检测分析方法它是建立在某一供应商的碳18柱上我知道有另一个厂家生产同样的碳18柱但价钱是它的一半如果我更换柱子会不会影响到分析方法答：要看这一分析方法的具体要求如果方法中有说明使用某一色谱柱或与其同样的柱子那么就可以使用别的柱子来替换但要注意不能光看一个柱子标为碳18柱或是其宣传等价于某某柱就认为该柱适用于所有方法必须要验证色谱柱的等价性我们需要考查使用新柱子时系统适应性是否可以通过验证如果可以获得系统适用性测试中所要求的保留值分离度以及其它参数等就可以使用该柱推荐使用系统适用性测试样品以及其它的典型样品来进行考查以保证杂质和降解物在正确的保留时间出峰并给出正确的浓度响应；并且在新柱子上获得的分析结果要等价于在原柱子上的结果79、请问我做一种药的分析查美国药典规定使用100mm×40mm8μm的色谱柱流速3mLmin可现在市场上已不容易找到这种规格的产物于是我按USP中色谱柱比较的数据库的指引选了一款选择性一致的等价色谱柱其规格是100mm×46mm3μm的色谱柱当选用3mLmin的流速时发现柱压超高请问我如何对方法进行调整以满足USP的要求答：流速调整原则是流动相通过柱子的线速度一致等价柱的截面积大了流速也应增加才能保持相同的线速度新流速计算结果是：（4.6/4.0）2x3.0=4.0ml/min但3ml/min流速都已导致柱压太高4.0ml/min明显不行好在USP还有个允许±50%的流速调整指导原则这样将流速调至2.0ml/min既符合USP规定又能使柱压降到可接受的范围但这种改变不能引起其它不好后果这个例子中等度分析中流速改变会引起塔板数和峰宽的改变但不会影响峰的选择性3um粒径色谱柱柱效比8um的高很多可考虑缩短柱长以补偿或部分补偿流速降低造成的测定时间增加所以更佳选择是50 mm ×4.6 mm, 3μm的柱子2.0ml/min的流速运行可以在符合USP规定的情况下又得到更快速的测定分离80、最近我非常的沮丧按照药典上的色谱条件和方法做某药物的分析却始终得不到满意的结果有人建议我对色谱条件如进样量、流动相pH和温度等进行微调以得到良好的峰形和分离效果可按公司规定我不能这样做怎么办答：如果你心里老有这个思维定势按规定我不能......然后什么也不敢做那真是不好办只有去做了去试着改变条件看看得到什么结果你才能发现问题所在如果改变条件后仍得不到好结果就要去找色谱条件以外的原因如色谱柱、色谱仪器以及样品和制样过程中的是否存在问题不管通过微调你是否取得了好结果你也有了向领导汇报问题和解决方案的依据而且绝对不能调整药典规定色谱条件的说法通常是不对的美国药典USP说的是如果改变药典方法需要重新做方法验证但方法调整或者称微调以符合系统适应性的要求是允许的是不需要重新做方法验证的USP列了调整的几条指导原则如±50%的流速调整±10 °C的温度调节等等（详见"Chapter 621,Chromatography," United States Pharmacopeia No. 31-NF 26, (2008).）当然既然是指导原则这些规定都不是绝对的如温度调整±10 °C对有些方法适用对另外的方法则±5 °C的调整都会有问题我们应该依据具体情况作出明智的科学判断81、请问下HibarRT250-4这个柱子很特殊么为什么很多药典中的药物分离都用它做柱子因为才开始做药不知道hibar的柱子特点是什么答：HibarRT250-4是Merk的一个品牌不是很了解大概是共用柱头可更换的柱管82、在碱性条件下硅胶溶解又生成硅羟基的机理是什么反应方程式如何写答：二氧化硅溶解的反应式是：SiO2+2OH-=Si032-+H2O或者表示成水解的形式：SiO2+H2O=Si032-+2H+这说明硅胶会在碱性条件下溶解而生成硅酸根但我们这里说的是硅胶颗粒表面的部分溶解含有键合固定相的硅胶原表面溶解脱落后自然会生成新鲜的硅胶表面而新鲜的硅胶表面结构一般都是含有硅羟基的硅胶基本结构单元是Si-O-Si键在OH-离子的作用下Si-O键断裂在表面形成Si-O-H硅羟基的结构单元必须指出的是在氨基柱的孔内并没有单独加入OH-离子偏碱小环境的形成是由于氨基易和水电离生成的氢阳离子结合造成的游离OH-离子的过剩从第一个方程式角度解释游离的OH-离子用完硅胶就不再继续溶解；从第二个水解形式方程式角度解释：当硅胶水解生成的H+ 离子足够用来和氨基结合时水解过程就会变慢或停止83、同样都是C18柱子液相色谱柱和SPE他们之间有什么区别能具体讲一下么答：HPLC柱子和SPE小柱的对比：对比项目 HPLC SPE柱管 不锈钢管 塑料管粒径（um） 3,5,10 40-300颗粒形状 球形 一般为无定形柱效（塔板数）20-25000 <100分离机理 连续洗脱 数字式开关洗脱售价（元） 1000-4000 10-40使用方式 可重复使用 一次性使用操作成本 较高 低设备成本 高 低对于C18固定相为了提高回收率SPE里用的C18填料一般载碳量相对更高84、我从上面了解到RP18和C18的区别是极性强一些能问一下他们在分析农药是可不可以通用C18适用于那些农药的分析我查材料看到苯醚甲环唑都是用C18分析的可我用C18分析发现响应值很小没法分析能帮忙分析一下原因么答：RP18和普通C18肯定有其不同的适应性农药种类这么多可能大部分农药两者都能用有些就不一定你问的C18适用于哪些农药应该从相关农药分析方面的书籍手册中可以查到具体什么农药用什么色谱条件合适其中里面肯定有选择什么类型柱子我这边没办法一一列举液相色谱中60%以上的分析物可以用C18柱我想也应该有60%以上的农药可以用C18柱如果手册或文献中查不到你把农药作为普通分析物来对待然后按照一般的色谱柱选择和方法建立原则来做就可以选择决定因素应该也是农药分子的结构苯醚甲环唑应该含有极性基团可以试试极性强的C18柱85、我在用乙腈作流动相时只要那个乙腈比例稍高一点比如20%即使测量波长高于乙腈截止波长比较多也会产生比较大的溶剂峰这怎么回事答：如果出现溶剂峰对你的分析结果没任何影响那就让溶剂峰在那儿好了或者你用规定的溶剂溶解提取样品后再用流动相稀释一下样品如果稀释后检测限能达到的话86、我在做一个模拟胃内容物中药物反应试验需要动态测定某药品含量变化分析时碰到一个棘手问题进样量同样用20ul用对照品进样时色谱峰形不错进样品时却一直不能得到好的峰形后来分析是模拟胃内容物样品的酸度过高的因素可我通过稀释的方法让样品酸度和流动相接近虽然峰形没问题了却发现因稀释导致分析物在样品中含量下降低于最低检测限了如何是好呢答：稀释很方便但灵敏度更高的检测器不容易找不过还是有个简单的解决方案当用流动相稀释样品时只要稀释后样品中有机相含量比流动相中的有机相比例低10个百分点以上（如流动相中甲醇含量是40%则样品中甲醇含量一定要低于30%）样品流动会被色谱柱进口端延缓或阻挡称为柱上富集由于柱上富集作用的存在这种情况下进行大体积样品进样可避免样品溶剂组成和流动相一样时进样量过大产生的峰展宽针对你提的这个实例可用稀的NaOH溶液调节样品pH和流动相匹配并将样品最终稀释一倍将进样量提高一倍到40ul就可达到最低检测限的要求87、峰形后拖尾是什么原因造成的答：[柱物理损坏]色谱柱有物理损坏是造成峰形拖尾的根源唯一的解决方法就是更换新柱[柱内填料污染]流动相和样品中的杂质是色谱柱主要污染源流动相所用的各种溶剂至少是分析纯尽量使用色谱纯试剂流动相所用的水最好是超纯水或全玻璃器皿双蒸水用前先用0.45um溶剂微孔过滤（器）过滤除去可能存在的微粒流动相建议现用现配对于含盐的溶液尤其注意长置会产生细菌或出现沉淀此外还得保证储存流动相的容器清洁复杂样品可选用0.45um溶剂微孔过滤（器）或样品预处理柱对样品进行预处理确保样品中不含微粒杂质若样品不便处理要使用保护柱柱内填料污染时可将柱头螺丝卸下用专用工具挖出柱内前段被污染填料再以相同的填料重新填入修复或以能溶解污染物的流动相按色谱柱使用的相反方向冲洗色谱柱（约20至30倍柱体积或视具体情况而定；另外此时不能接检测器）将污染物冲出色谱柱再按色谱柱标明的使用方向使用[柱进口处有异物]当断定是柱进口处有异物时可将柱头螺丝卸下取出滤帽并将其置于20%硝酸溶液中用超声波清洗约20分钟再置于超纯水中并用超声波清洗约10分钟重新装入色谱柱内即可[样品浓度过高致使柱超载]样品在柱上超载能引起峰展宽拖尾（或伸舌）适当减小进样量或样品浓度（需要时可提高检测器灵敏度）直至峰形和保留时间不再改变便可消除这种不良影响减小进样量还能改善其分离度正常情况下样品中每种化合物在150×4.6mm柱中进样量保持在3～50ug范围内不会引起明显超载[样品溶剂不对]选择合适的样品溶剂以排除不必要的干扰最好选用流动相溶解样品[柱外效应]柱外效应（即进样阀、色谱柱及检测器间的管路过长、直径过粗、管路接头不匹配、有死体积）是影响色谱柱柱效的主要因素之一所以在可能的条件下色谱柱的两端连接管路要尽可能短连接管内径尽可能细小切口务必平整光滑尽可能的减小死体积以防止因样品扩散造成不能反映色谱柱真实柱效等情况发生[缓冲不足或不合适]在缓冲不好或离子强度过低的分离中也会出现保留时间重现性差和峰形拖尾增加缓冲浓度（与样品大小相匹配）能改善此情况[硅醇基团作用]仔细分析色谱柱内填料表面性质可知：反相色谱柱填料的表面大约被键合相覆盖了一半其余的就是未被键合的硅醇基团所谓的保留是指样品分子与键合相相互作用的结果但是酸性或碱性化合物与硅胶表面残存的硅醇基团或金属杂质之间相互作用而引起双重保留机理因此发生了峰形拖尾为了减小峰形拖尾通常可在流动相加入25mM三乙胺（抑制剂）三乙胺能与硅醇基团发生强烈的相互作用从而降低或阻断样品分子与硅醇基团的作用以保证保留机理正常进行并大大缓解了峰形拖尾使用长链的硅醇基抑制剂虽起效较慢但持续力较三乙胺长因为抑制剂分子中除了胺基与硅醇基团发生极性作用外大分子中非极性部分与固定相也会发生反相作用而产生保留现象如果将抑制剂加至样品中效果会显著[柱内金属污染]柱内金属污染（FeNi等）可引起某引些化合物峰形拖尾金属可由填料本身带进也可由腐蚀性流动相缓慢溶解柱进口的金属滤片随流动相沉积到柱填料中例如C18柱填料被金属污染后造成酸性/碱性样品拖尾可用碱洗/酸洗后再键合的填料得到的峰是尖锐且对称的88、流动相与柱子如何才能做到匹配达到最好的分离效果目前我们实验室有购买好的色谱柱可是对样品的分离效果不是很好答：不同填料的色谱柱都有自己的选择性相同填料不同厂家以及相同厂家不同品牌之间的选择性都是不一样的一般情况下根据物质的性质将分离的大方向如：正相分析或者反相分析确定后一般可以根据调节色谱条件能得到好的色谱峰形这方面的资料论坛当中很多但是也有些色谱柱不管怎么调整色谱条件都不行表面这款色谱柱的选择性不适合该样品的选择89、我用的是C18柱后面黑色的是我以前跑的图前面是我现在跑的图形完全一样的东西只是流动相不是一批配的（流动相的成分没变）中间柱子别人用过了峰型怎么发生了这么大的变化啊可能的原因是什么啊是不是柱子出了问题啊答：从两个图对比很明显可以看出是柱效严重下降且伴有肩峰不同时间配的流动相如果成分和pH没变的话肯定不会造成这个结果估计是别人用柱子过程中造成了柱头塌陷、柱头污染以及固定相流失等严重问题如样品太脏流动相或样品pH太高或太低都会造成这个结果你可以试着用色谱柱清洗和再生的方法反冲维护一下但不能保证一定能回到原来的效果再生如果不行考虑挖补柱头填料实在不行柱子也只能报废建议柱子最好还是专门用于一种方法比较好像你这种情况都搞不清别人怎么用柱子的分析解决问题就相当难90、柱子的柱效影响大吗一般柱子的柱效规定是多少的呀理论塔板数一般要达到多少呢主要有那些因素影响它答：柱效是柱子性能好坏的一个重要体现指标柱效会影响分离度当然是峰形越尖锐柱效越高和其它峰越容易分开另外柱效高峰形尖锐对峰面积的积分误差就小甚至可以用峰高来定量一般C18柱在测定甲苯等不易拖尾的小分子中性不电离物质时5um的填料每米的柱效能达到80000以上的塔板数就算合格吧在实际分析物的测定时一般药典有规定最低柱效是2000-3000一般新柱子的柱效都高于这个数但柱子在使用后由于固定相流失等原因柱效会逐步下降当下降到不符合药典最低柱效要求或者导致分离度不够时色谱柱就算寿命到了单从柱效逐步下降这个角度看柱效高的色谱柱相对使用寿命更长影响柱效的因素有粒径、粒径和孔径分布、固定相键合密度、柱外体积和温度等柱子装填紧密、柱床均匀一致也对提高柱效有好处这些影响因素中很多是和生产厂商有关你这边能做的是尽量减少柱外连接体积91、流动相中加入四氢呋喃对柱子有损害吗?我现在分析一样品流动相中用到20%的四氢呋喃才能把峰分到基线.但柱子只能用一个星期分离效果就不好了.请问是四氢呋喃损坏了柱子吗?答：四氢呋喃（THF）是反相色谱中洗脱能力极强的溶剂比甲醇和乙腈都强很多在流动相中加入THF能改善某些难分离的物质对的分离度但THF不稳定容易降解生成具有很强反应活性的过氧化物能与分析物反应生成新化合物导致拖尾、峰分裂和鬼峰产生高反应活性的过氧化物还可以和填料固定相发生化学作用THF对柱子有损伤这点是无疑的而且这种损伤是随时间累积的THF保质期一般规定是6个月放得越久里面产生的过氧化物含量越大你应该避免使用生产日期已很久的THF溶剂而且最好将THF冷藏、干燥和避光保存使用前最好能检测一下过氧化物的含量92、在用液相色谱同时分离多种组分时怎么通过条件色谱条件使各个峰达到比较理想的分离效果答：这是方法开发的大问题方法开发建立要做的就是：针对分析物和基体的情况不同选择色谱柱类型和分析条件包括流动相溶剂类型、组成比例、pH值、温度和流速等参数的确定这方面的问题要讲起来内容非常多93、是样品过载问题,按药典检测方法检验一些药品有关物质时,都要注入高浓度的供试液,这样往往使得柱过载而峰变形,按老师的方法减小浓度和注入量均是不允许的,怎么处理这问题?答：药典方法中注入高浓度供试液测定有关物质提高注入浓度是为了把杂质峰的信号增强有时候为了把杂质峰显现出来主峰因过载有所变形如在允许范围内也能接受但前提是杂质峰和样品主峰分开如果因过载而使两峰没有得到需要的分离度杂质峰信号再强也失去了意义我认为药典规定的条件是允许在一定范围内进行调节的因为药典没有规定具体使用色谱柱的品牌而不同品牌的柱子上样量是有差异的对色谱条件微调并取得到了很好的分析结果如果规定不允许那你首先要怀疑这个规定是否合理或者是否对规定的理解有问题94、哪些原因会造成色谱峰变宽、峰高变低有哪些解决办法答：确实是这样如果其它色谱条件没有改变柱效下降是导致峰变宽的主要原因对于易电离的极性物质如果流动相pH选择不合适分析物既有中性分子态存在又有离子态存在峰也会变宽变矮色谱柱使用后柱效逐步下降是正常现象如突然降低则属异常柱效下降原因有很多但柱效快速下降则多半是使用不当造成填料特性或柱床结构改变所致如超过使用pH范围造成的固定相和硅胶基体的流失、柱床塌陷等；还有强保留物质吸附在填料表面形成非特异性吸附层完全改变了原有固定相的表面活性和分离性能使柱效下降；另外进样时的压力脉冲也会破坏柱床结构影响柱效95、我以前做苏丹红用的是安捷伦的SB-C18柱峰形什么都很好最近发现4个标样峰后都带有一个小峰一开始以为是标样问题后来换XDB-C18后标样又正常了可是用SB-C18柱做其他用正常不知怎么回事还有像这种C18柱如果压力过高能不能反冲该如何冲洗一般做兽残、农残什么的而且感觉三聚氰胺做后压力更易增高且容易引发进样器漏等问题请问做完三聚氰胺需对系统做特殊清洗吗答：用SB柱标样后带一小峰而且是只对苏丹红标样测定时有估计和苏丹红标样的测定方法和其它样品测定方法不同有关最好能把谱图贴上来看看是什么样的小峰才能判断是溶剂峰还是杂质峰XDB柱和SB柱是有区别的XDB键合度高封尾良好反相保留能力强；而SB柱未进行封尾对极性物质选择性好有可能你的苏丹红标样分解了有极性杂质生成SB柱能把杂质分开而XDB柱不能这两款柱子压力大了可以反冲有正常维护时的反冲冲洗和再生时的强溶剂冲洗两种冲洗方法在在线讲座里也写了你再回到本贴的前面看看就可以了三聚氰胺和三乙胺类似本身容易和硅醇基作用而吸附在填料表面另外三聚氰胺测定的样品基体含蛋白类的强保留物质较多容易污染色谱柱柱头引起填料间隙堵塞柱压升高最好每次做完样后都用甲醇或乙腈反向清洗维护一下如有蛋白类的污染也定时用本讲座中提到的清洗方法做一下维护96、我是做农药残留分析的不同的基质杂质含海量是不同的我用C18分析时有可能一次就污染了我用高流速和反向冲洗都解决不了是不是这根柱子就废了有没有其他的办法答：高流速反向冲洗是对的关键你用了什么溶剂冲洗呢用原来的流动相冲洗肯定不管用要不然就不会累积在柱子上了你应该用流动相中的强溶剂B冲洗如果不行就需要启用再生的程序当然再生时用的溶剂更强100％甲醇---100％乙晴---75％乙晴/25％异丙醇---100％异丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷用每种溶剂冲洗至少10个柱体积对于250mm×4.6mm的分析柱合适的冲洗流速是1～2ml/min最后用10柱体积的异丙醇过渡然后回到原来的流动相体系再生还不解决问题最后一招就是挖补柱头填料把柱头污染的填料挖掉用干净填料填补进去挖补填料破坏原有柱床结构挖补后柱效也不可能有新柱水平或许能再维持一段时间但不会长久97、还有溶剂中的金属过滤头生锈了会有什么影响会不会影响到柱子的寿命金属离子和柱子有没有什么反应答：我觉得你就把锈当成颗粒物污染的一种会导致拖尾、柱压上升等溶解的金属离子一般在反相柱上没有什么保留能力马上就会被冲出柱子不会和固定相或者和硅胶基质反应98、如果在溶剂过滤时把水膜当成有机膜了溶解了而且这样的溶剂又做有机相用了造成C18柱压由1000升到3000流动相是乙腈和水问一下这样的柱子还能用么有没有什么补救方法答：溶解的膜作为了颗粒物堵塞筛板引起柱压上升也只有反冲一下如果能把堵在筛板上的膜残渣冲走柱压下降了就OK了；如果残渣进入了柱子内部的填料间隙会难冲一点也只能多冲一会吧实在不行你又舍不得把色谱柱报废就只有挖补柱头填料和换筛板了99、保护柱和预柱的作用是不是一样的如果不一样有什么区别么保留时间漂移多少为可以接受的范围答：保护柱一般带填料相当于一根缩短了的色谱柱（一般是1-2cm长度）卡套里可更换的柱芯柱管、筛板和填料都有保护柱里的柱芯好像是在前面开路的扫雷部队流动相和样品里如有什么损害柱子的污染物保护柱就自己承受了下来而预柱现在一般指的就是接在进样器和色谱柱之前的在线过滤器在线过滤器和保护柱的最大区别是不带填料只有可更换的筛板预柱只能保护色谱柱免受颗粒物质的污染而不能阻挡溶解在流动相中的强保留物质保留时间是液相色谱中一个很有用的诊断分离问题的工具保留时间受流动相组成、温度、pH、流速、固定相流失和柱老化等很多因素的影响如果所有这些参数保持不变保留时间也保持恒定但在实际操作中不可能对每个色谱参数进行很完美的控制如即便加了柱温箱温度还是会有波动；流动相组成会因组分挥发性不同而改变所以保留时间有上下0.02-0.05min的变动是非常正常的对某些方法有0.1min上下变动也属正常保留时间有大的变化预示着系统和方法存在问题流路里有气泡存在泵阀有泄漏会因流量降低而导致保留时间增加梯度混合比例阀故障也是保留时间变化原因之一100、液相色谱柱与气相的柱子有何区别呢答：HPLC是走液体的分正相反相反相为例Si接着C18（键和相）,电镜下看起来像绒毛一样的所以一般用甲醇乙腈保护RP柱这样它的绒毛呈舒展状GC走气体的固定相涂布固定液来源：化学先生编辑整理：德斯特cGMP版权及免责声明：本公众号所有文章除标明原创外均来自网络登载本文的目的为传播行业信息内容仅供参考如有侵权请联系德斯特删除文章版权归原作者及原出处所有本公众号拥有对此声明的最终解释权德斯特cGMP团队一直致力于国际GMP认证咨询；针对美国GMP认证, 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